- Kada se misli o pojmu regenrativne medicine, nekako prva asocijacija je vezana za matične ćelije. Međutim ona je zapravo mnogo više: odnosi se i na druge vrste ćelija kao što su trombociti, ali i na proizvode određenih ćelijskih loza, proizvode koji deluju regenrativno ako se primene u lečenju obolelih tkiva i organa. Pojam u širem smislu obuhvata i imunomodulaciju, reparaciju, angiogenezu, antiinflamatorno dejstvo, antibakterijsko dejstvo, diferencijaciju, hemotaksu... Ali krenimo redom. U seriji tekstova koji će uslediti, pokušaćemo da razjasnimo neke pojmove, nedoumice, i aspekte primene regenerativne medicine.
Regenerativna medicina je zapravo uvećanje broja i zamena obolelih ili povređenih ćelija ili tkiva na jedan od dva načina:
-
Unapređenjem sposobnosti endogenih ćelija da zamene oštećeno tkivo
-
Korišćenjem egzogenih ćelija ili tkiva koja će zameniti ona oštećena.
Ako imamo nameru da koristimo sve prednosti regenerativne medicine moramo dobro razumeti biologiju ćelija i molekularne signale među njima. Ćelijski signali su kompleksna i još uvek nedovoljno istražena pojava usled višestrukih interakcija između komponenti telesnih sistema. Svaka ćelija vrši sekreciju signalnih proteina koji utiču na samu ćeliju (autokrino) ili na ćelije u susedstvu (parakrino) putem interakcije sa receptorima lokalizovanim na ćelijskoj membrani. Razumevanje intercelularne komunikacije kao i intracelularne transdukcije je esncijalno u rešavanju misterije reparacije i regeneracije oštećenih tkiva. Još više, radi postizanja ovog cilja, u osnovna saznanja iz ove oblasti moramo integrisati i infromacije koje nam daju istraživanja novih terapeutskih tretmana koji su dali rezultate brže i efikasnije regeneracije tkiva.
PRP (Platelet Rich Plasma) – plazma bogata trombocitima
Trombociti čine tek 0,4% svih ćelija krvi. S druge strane, njihova uloga u zarastanju rana je nezamenljiva.
Trombociti (zeleno zaokruženo)
Funkcija trombocita je:
-
Hemostaza
-
Učešće u inflamatornom i imunološkom odgovoru organizma (oslobođeni citokini i hemokini iz α granula regrutuju i privlače leukocite u inflamirano područije)
-
Zarastanje rana
-
Izgradnja matriksa za regeneraciju tkiva
-
Privlačenje matičnih ćelija na mesto oštećenja
-
Sadrže razne faktore rasta u visokim koncentracijama
Postoji direktna veza između koncentracije trombocita i količine faktora rasta koji se mogu naći u plazmi bogatoj krvnim pločicama. Tako se u PRP, u odnosu na normalnu krv može naći:
-
130X veća koncentracija PDGF – platelate derived growth factor
-
80X veća koncentracija TGF β– transforming growth factor
-
11X veća koncentacija VEGF – vascular endothelial growth factor
-
U nešto manjim koncentracijama se nalaze IGF1, HGF, BFGF (basic fibroblast growth factor)
Ovi faktori rasta, stimulišu proliferaciju fibroblasta, sintezu kolagena tip1 i tip3, angiogenezu, posebno u tkivima koja sadrže mali broj krvnih sudova, kao što su tetive, ligamenti i zglobovi.
U poslednjih deset godina PRP tehnologija je izuzetno napredovala. Korišćenje autolognih molekula faktora rasta (GF) i citokina, u raznim indikacijama, dalo je izuzetan podstrek razvoju regenerativne medicine. Jednostavni protokoli u pripremi PRP, bezbednost u lečenju, kao i različiti protokoli u primeni, stimulisali su i prenos težišta sa bazičnih istaživanja na praktičnu terapijsku primenu. Otkrića u ovoj oblasti nisu samo doprinela uspešnim tretmanima kod različitih indikacija, već i istraživanju celularnog i molekularnog mehanizma zarastanja i isceljenja oštećenih tkiva. Ova tehnologija pruža nam mogućnost da naše akademsko znanje o pomenutim molekulima pomerimo ka praksi, harmonizujući ‘brak’ između bazične nauke i istraživanja sa jedne strane i kliničke prakse sa druge.
Aktivacijom trombocita komponentama ektracelularnog matriksa, kao i mnogim sloubilnim agonistima, oslobađa se više od 300 aktivnih molekula koji se nalaze u intracelularnim granulama. Ovi molekuli aktiviraju druge tromocite, i izazivaju odgovor drugih ćelija. Mikro-okruženje u kojem se formira tromb, kao i uloga trombocita u fiziološkim i patološkim procesima, zahteva njihovu sekreciju u vrlo usko definisanom prostornom i vremenskom intervalu, kako bi se osigurao odgovarajući odgovor na veliki broj različitih stimlusa.
Unutar trombocita postoje α i δ granule kao i lizozomi. Upravo tim redosledom su i zastupljeni u trmbocitu: α granula ima 50-80, dok δ granula ima 3-5 i samo 1-2 lizozoma. Lizozomi sadrže proteolitičke enzime, a δ granule sadrže male molekule – aktivatore trmobocita. Sadržaj α granula je najkompleksniji – one sadrže brojne faktore koji imaju različita dejstva u zavisnosti od vrste ćelija na koje deluju. Obzirom na kompleksnost dejstava trombocita u organizmu, koja se grubo mogu podeliti na ona poželjna (fiziološka) i na nepoželjna (patološka), u ovom tekstu biće razmotrena samo ona dobra, poželjna dejstva, koja su na kraju krajeva i najvažnija u regenerativnoj medicini i njenoj terapeutskoj primeni.
Lizozomi – sadrže kiselu fosfatazu, i heksozaminidazu, proteolitičke enzime koji učestvuju u razgradnji i remodeliranju ugruška, što zapravo u nekim slučajevima može imati i negativne konsekvence (šlog, infarkt).
δ granule – ATP, ADP, Ca, Mg, histamin, i pirofosfati, učestvuju u aktivaciji trombocita, što je opet u zavisnosti od mesta i vremena sekrecije 'mešana' funkcija sa dobrim/lošim ishodom. 5-hidroksitriptamin učestvuje u regeneraciji jetre.
α granule – biće pomenuti samo najvažniji molekuli.
-
Proangiogeni faktori: VEGF (vascular endothelial growth factor), hemokin CXCL12, i anti-angiogeni faktori: angiostatin, PF4 (trombocitni faktor 4), endostatin, i trombosponidin-1. Svi oni utiču na integritet mikrocirkulacije i limfne cirkulacije.
-
Hemokini i citokini: CXCL7, CCL5, IL8, i IL1B imaju ulogu u procesu inflamacije, kao i anti-bakterijska svojstva
-
Adhezivni molekuli: fibrinogen (FGA, FGB, FGG), fibronektin, vW faktor, i P-selektin, učestvuju u leukocitnoj adheziji.
-
Timozin β4: učestvuje u procesu zarastanja rana.
-
Faktori rasta: PDGF, TGFB1, EGF, IGF1 – učestvuju u regeneraciji srčanog mišića i drugih tkiva
-
Faktori koagulacije: F5, F11i protein-S i anti-koagulacioni faktori: antitrombin i proteaza neksin- II, regulišu hemostazu u organizmu.
U tabeli 1, dat je nešto duži spisak glavnih molekula u α granulama:
Funkcija trombocita u organizmu, zbog svih pobrojanih fizioloških ali i patoloških dejstava, očigledno zavisi od signala u organizmu – da li u određenom područiju postoji krvarenje, inflamacija, infekcija ili nešto treće. U ovom tekstu fokus će biti samo na onim aspektima koji se tiču životinja, gde je terapija sa PRP klinički primenjiva i daje dobre rezultate. Ali prvo da vidimo kako se priprema PRP.
Priprema PRP
Periferna krv je izvor koji koristimo za pripremu PRP. Prosečan broj cirkulišućih trombocita je oko 200.000/µl. Krv se uzima sterilno sa ili bez antikoagukansa, a plazma se priprema centrifugiranjem ili filtracijom. Količina se adaptira prema kliničkim potrebama, u količini od 10-100ml. Postoje tri načina za pripremanje PRP:
-
Dvokratno centrifugiranje pri kojem se koriste automatizovane mašine i komercijalni kitovi za pripremanje PRP. Ovom metodom se mogu koncentrisati trombociti 4-8X, od osnovnog nivoa., a takođe se koncentrišu i leukociti. Shono tome, u zavisnosti da li su naknadno izdvojeni leukociti ili ne razlikujemo potpuno čistu plazmu bogatu trombocitima (P-PRP, pure platelet rich plasma), i plazmu bogatu leukocitima i trombocitima (L-PRP, leukocytes and platelet rich plasma)
-
Jednokratno centrifugiranje pri kojem se koristi klasična laboratorijska centrifuga, nakon koje sledi manuelna separacija PRP. Ovom metodom se mogu koncentrisati trombociti 1-3X, od osnovnog nivoa.
-
Selektivna filtracija krvi za koju se koriste komercijalni kitovi.
Na slici su prikazana prva dva načina dobijanja PRP.
Pitanja bezbednosti primene PRP, i pored duogodišnje uspešne kliničke primene, ostaju. Kod životinja kao i kod ljudi, izbegava se alogena i ksenogena primena kako zbog mogućeg prenosa nekih bolesti, tako i zbog mogućih imunoloških i alergijskih reakcija. Međutim i to se menja – sada se već koriste proizvodi koji sadrže bovini trombin za aktivaciju PRP, ali mogućnost nastanka koagulopatija je velika, te se u tu svrhu koristi rekombinovani trombin za određenu životinjsku vrstu. Na kraju, ali ne manje važno, za sada je aplikacija PRP striktno lokalna i kod životinja i kod ljudi, u zavisnosti od indikacija, upravo zbog opasnosti od nastanka koagulopatija.
Indikacije
Osteoartritis (OA, psi, konji, ljudi) – OA je klinički heterogeno i relativno slabo istraženo patološko stanje. Većina istraživača ali i praktičara pri tom misli isključivo na destrukciju zglobne hrskavice. Međutim patogeneza OA, osim hrskavice, uključuje i sinovijalnu membranu, subhondralni deo kosti, kao i vezivno-tkivne strukture koje učvršćuju i stabilizuju zglob. Posebno sinovijalna membrana, koja je izuzetno reaktivna na mikrofragmente zglobne hrskavice, privlači leukocite iz cirkulacije i propušta ih u zglobnu šupljinu. Faktori rasta oslobođeni iz trombocita igraju odlučujuću ulogu u obnovi hrskavice. TGF-β podstiče regeneraciju hrskavice podrškom sinteze ekstracelularnog matriksa koji proizvode mezenhimalne matične ćelije diferentovane u hondrocite. One takođe suprimiraju interleukin-1 koji smanjuje sintezu proteoglikana. PDGF održava hijalini fenotip hrskavice, pospešuje proliferaciju hondrocita i sintezu proteoglikana. IGF-1 takođe pospešuje sintezu proteoglikana, i usporava njihov katabolizam. U svakom slučaju, praksa je pokazala da PRP ima pozitivno dejstvo kod slabijih i srednje izraženih OA. Kod uznapredovalih i teških oblika, dejstvo im je zanemarljivo. U slučaju OA, PRP se aplikuje intraartikularno u oboleli zglob. U zsvisnosti od težine kliničke slike, aplikaciju je potrebno ponoviti nekoliko puta u razmacima od 1-2 nedelje, do prestanka ili umanjenja simptoma.
Aplikacija PRP u kičični zglob kod konja
Povrede tetiva i ligamenata (konji, ljudi) – kod sportskih konja povrede tetive površnog svijača prsta i suspenzornog ligamenta čine ubedljivo najveći procenat svih povreda. PRP se pokazao kao prilično evfikasan u njihovom saniranju. Čak i kad je više od 50% tetivnih vlakana pokidano, terapija trombocitima je ubrzavala zarastanje povrede sa minimalnim ožiljkom. Praksa je pokazala da je najbolje aplikovati PRP u početku subakutne faze, kada počinju da se razvijaju reparatorni procesi. Tada trombociti ubrzavaju i pojačavaju ove procese, što znači manji ožiljak, i oporavak za kraće vreme. Kod ovih povreda je obično dovoljna jedna aplikacija PRP, koja se izvodi direktno u povređeno mesto vođeno ultrazvukom. Ako je tetiva ili ligament povređen na više mesta, PRP je potrebno aplikovati u svako povređeno mesto. Dakle od karaktera povrede zavisi i koliko ćemo PRP napraviti. Naravno period rehabilitacije je od najveće važnosti, te se može desiti da ako ona nije sprovedena korektno i u potpunosti, da sama terapija ne da željeni rezulatat.
Rane i ulceri koji teško zarastaju razne etiologije (psi, konji, ljudi) – razlika između akutnih i hroničnih rana se može objasniti u jednom delu kao alteracija u lokalnom biohemijskom okruženju. Na primer, kod akutinh rana je veća mitotička aktivnost nego kod hroničnih, dok kod hroničnih rana je veći nivo proinflamatornih citokina nego kod akutnih. Kada hronična rana počne da zarasta, slabi inflamatorni proces. Visok nivo aktivnosti proteaza kod hroničnih rana direktno utiče na slabo zarastanje, zbog degradacije proteina koji su neophodni za normalno zarastanje. U praktičnom smislu pod hroničnim ranama se smatraju one rane koje ne zarastu za tri meseca. Celularni, biohemijski i molekularni procesi koji karakterišu ranu koja ne zarasta su dobro poznati, i uključuju produženu inflamatornu fazu, ćelijsko starenje, deficit u faktorima rasta i/ili njihovim receptiorima, mala produkcija fibrina i visok nivo proteaza. Kod rane koja normalno zarasta, akutna inflamatorna faza se karakteriše neutrofilnom infiltracijom, koji su bogati matriks-proteazama koje vrše debridment rane, stvarajući uslove za sintezu novog, zdravog tkiva. Kod hronićčne rane ovaj proces je poremećen nekim faktorom, te je inflamatorna faza produžena, nagomilavaju se neutrofili, makrofage i limfociti, koji luče proteolitičke enzime koji vrše degradaciju matriksa – primećen je vrlo viosk nivo matriks-metalo-proteinaze, kao najvažnijeg matriks-degradirajućeg enzima. To izaziva celu kaskadu rekacija tkiva rane koja ostaje u nezarastajućem stanju. Zbog toga bilo koji tretman ovakve rane podrazumeva prekidanje ovog začaranog kruga produkcije enzima i molekulskih signala koji vode ka destrukciji tkiva. Faktori koji na ovakav razvoj događaja mogu uticati su ponovljene traume, strana tela, nekroza tkiva, infekcija rane, ishemija i hipoksija tkiva. Zato prilikom upotrebe PRP u lečenju teško zarastajućih rana treba imati na umu da istovremeno moramo otkloniti uzroke koji su doveli ranu u to stanje. U nekim slučajevima to nije moguće, kod dijabetisa recimo, ali i u tim slučajevima terapija PRP daje dobre rezultate. U zavisnosti od veličine rane treba napraviti veću ili manju količinu PRP koja će biti aplikovana direktno u ranu difuzno – kako po rubovima tako i u sredini rane. Količina po aplikovanom mestu bi trebala da bude 0,1-0,3ml, a sama mesta aplikacije ne bi trebala da budu na većoj udaljenosti od 0,5cm.
Druge indikacije – u humanoj medicini PRP se vrlo uspešno upotrebljava u oftalmologiji u lečenju kornealnih ulcera, ali i svih drugih kornealnih defekata kod kojih je poremećena ili potpuno izostaje epitelizacija. Dalje, koristi se i u ortopediji za akceleraciju zarastanja fraktura (posebno kod teško zarastajućih fraktura) nakon osteosinteze, kao i prilikom rekonstrukcije prednjeg krucijalnog ligamenta, zatim povreda i istezanja mišića i povreda pripoja mišića kod sportista. Kod ljudi se još koristi i za regeneraciju perifernih nerava, kao i za regeneraciju miokarda nakon infarkta. Koristi se i u estetskoj hirurgiji, kao i za obnovu kože. Na kraju, sve je više kliničkih studija o povećanju efikasnosti matičnih ćelija, kod raznih indikacija, ako se aplikuju zajedno sa PRP. Sve ove indikacije u humanoj medicini i njihova klinička primena je zapravo putokaz veterinarima praktičarima kojim putem bi trebalo da krenu kada je u pitanju uvođenje ove biotehnologije u kliničku praksu.
Janko Mrkovački DVM
direktor Stem Art d.o.o.