Farma_cenej

    Intrauterina inseminacija na farmi Čenej

                    (B. Stančić i sar.)

U praktičnim uslovima primene veštačkog osemenjavanja, fertilitet nerastova, odnosno stepen njihovog reproduktivnog iskorištavanja, je mnogo značajniji od reproduktivne efikasnosti krmača u priplodnom zapatu. Naime, u najboljem slučaju, krmača normalno proizvede oko 25 prasadi godišnje, dok jedan nerast proizvede 6000 do 7000 prasadi godišnje. Međutim, zbog sve veća potreba da se, radi bržeg dobijanja što većeg broja grla sa visokim genetskim potencijalom za poželjne produktivne osobine, kao i zbog činjenice da cena jedne inseminacione doze učestvuje sa preko 50% u ukupnoj ceni veštačkog osemenjavanja, nameće se potrebu za povećanjem reproduktivne eksploatacije genetski superiornih nerastova. U principu, ovo se može postići na dva osnovna načina: (a) povećanjem produkcije sperme kod nerastova i (b) povećanjem broja inseminacionih doza po ejakulatu.

Produkcija i kvalitet spermatozoida zavisi od brojnih spoljašnjih (mikroklimat, ishrana i frekvencija uzimanja ejakulata) i unutrašnjih (genetika, starost i zdravstveno stanje) faktora. Ove faktore je, međutim, vrlo teško kontrolisati i optimalizovati u proizvodnim uslovima. Sa druge strane, iako je povećanje broja inseminacionih doza po ejakulatu, u klasičnoj tehnologiji VO (intracervikalna inseminacija), je dosta limitirano, ipak se, tokom poslednjih 50 do 60 godina, broj spermatozoida u dozi stalno smanjivao. Na početku primene VO, broj spermatozoida, u dozi od 100ml, kretao se između 5 i 10 x 109. Neki noviji podaci pokazuju da današnja prosečna inseminaciona doza iznosi 80ml, sa prosečno 3,25 x 109 spermatozoida. Takođe se pokazalo da svaka krmača, primi prosečno 7,2 x 109 spermatozoida po jednom uspešnom osemenjavanju (2,2 osemenjavanja x 3,25 x 109). Ako prosečan ejakulat iznosi 70 x 109 spermatozoida, onda se sa tim ejakulatom svega 8 do 9 krmača može osemeniti 2,2 puta. Prosečno se, od jednog nerasta, dobija oko 5 ejakulata mesečno, odnosno oko 1200 inseminacionih doza godišnje. U današnjoj, sve intenzivnijoj proizvodnji, ova produkcija inseminacionih doza po nerastu godišnje se smatra nedovoljno efikasnom, kako u zootehničkom, tako i u ekonomskom pogledu. Zbog toga se, sve više, izučavaju mogućnosti inseminacije dozama znatno redukovanog volumena i broja spermatozoida u dozi, kako bi se znatno povećao broj inseminacionih doza po ejakulatu. Pri tome se mora voditi računa da inseminacija takvim dozama, ne smanji stepena postignutog fertiliteta krmača. Primena nekih novih biotehnologija u reprodukciji, takođe zahteva vrlo značajno smanjivanje broja spermatozoida za osemenjavanje. Tako je, naprimer, u tehnologiji in vitro fertilizacije (IVF) potrebno svega 20 do 1000 spermatozoida za uspešnu oplodnju oocita. Takozvana subzonalna mikroinjekcija samo jednog spermatozoida u ooplazmu oocita, takođe se koristi za uspešnu in vito fertilizaciju.

Primena inseminacije dozama manjeg volumena, sa znatno redukovanim brojem spermatozoida, u principu, pretpostavlja: (1) depoziciju inseminacione doze u dublje partije ženskog reproduktivnog trakta, kao i (2) dizajniranje takvih katetera,  sa kojima se može izvršiti uspešna intrauterina inseminacija. Za postizanje obe navedene pretpostavke, od primarne je važnosti dobro poznavanje anatomije i fiziologije ženskog polnog trakta, posebno u periovulatornom periodu, kao i fiziologije transporta i preživljavanja spermatozoida u ženskom polnom traktu.

 

Fiziologija transporta i preživljavanja spermatozoida u ženskom reproduktivnom traktu


Prilikom akta kopulacije, u kaudalne partije tela materice (corpus uteri), deponuje se prosečno 250ml sperme, sa nekoliko desetina milijardi spermatozoida. U isti deo materice se, kod klasične veštačke inseminacije, deponuje doza od 80 do 100ml razređene sperme sa 2 do 5 milijardi spermatozoida. Od mesta deponovanja, spermatozoidi se, pasivno transportuju (antiperistaltičkim kontrakcijama miometriuma), kroz rogove materice, do uterotubalnih spojeva i, dalje, u kaudalni istmus ovidukta, koji predstavlja fiziološki rezervoar spermatozoida. Tokom akta koitusa ili veštačke inseminacije, događa se nekoliko serija naizmeničkih antiperistaltičkih kontrakcija i relaksacija rogova uterusa. Svaka kontrakcija traje oko 60 do 90 sekundi, između kojih se javlja pauza (relaksacija), sličnog trajanja. Od kaudalnog istmusa do mesta oplodnje (kaudalna trećina ampule jajovoda), spermatozoidi dospevaju hiperaktivnim sopstvenim pokretanjem (tzv. aktivnim transportom).

Vrlo intenzivne antiperistaltičke kontrakcije rogova materive, tokom i neposredno posle inseminacije, imaju za posledicu da se manji broj spermatozoida nađe u ampuli i infundibulumu jajovoda, već nekoliko minuta posle inseminacije. Međutim, ovi spermatozoidi nisu kapacitovani, a njihova vitalnost je vrlo niska, zbog oštećene ćelijske membrane. Zbog toga oni nisu sposobni za oplodnju i bivaju izbačeni kroz kranijalni otvor jajovoda u abdominalnu šupljinu. Nije jasno da li je ovako brz transport manjeg broja spermatozoida do kranijalnih delova jajovoda samo jednostavna posledica vrlo frekventnih kontrakcija uterusa i jajovoda, tokom i neposredno posle osemenjavanja, ili ova pojava ima i neku specifičnu fiziološku ulogu. Njihovo prisustvo u kranijalnim delovima jajovoda, možda, predstavlja određen signal za sinhronizaciju procesa ovulacije i formiranje kompetentnog broja fertilizaciono sposobnih spermatozoida na mestu oplodnje. Ovakva sinhronizacija je veoma važna za uspešnu oplodnju. Poznato je, naime, da se ovulirani oociti veoma brzo (unutar 15 do 30 minuta), ciliarnom i miosalpingealnom aktivnošću transportuju do ampuloistmusnog spoja (mesto oplodnje) i tamo mogu ostati dosta dugo. Međutim, fertilizacioni život oocita u jajovodu traje dosta kratko. Ustanovijeno je naime, da se vitalni embrioni dobijaju samo ako spermatozoid izvrše penetraciju oocita unutar 6 do 8 sati posle ovulacije. Zbog toga su brz transport spermatozoida od mesta ejakulacije do utero-tubalnih spojeva, kao i brzo uspostavijanje kompetentne populacije fertilizaciono sposobnih spermatozoida u ampulo­istmusnom delu jajovoda, te dobra sinhronizacija ovih procesa sa momentom ovulacije, primarni uslovi uspešne oplodnje. Sledeći talas spermatozoida se pasivno transportuje kroz rogove uterusa znatno sporije. Tkom prolaska kroz rogove uterusa, ovi spermatozoidi su obavijeni jednom mukopolisaharidnom membranom, koju dobijaju prilikom mešanja sa spermalnom plazmom, za vreme proces ejakulacije. Ova membrana sprečava spermatozoide da prevremeno započnu sa procesom kapacitacije

Kad spermatozoidi, pasivnim transportom, dospeju do utero-tubalnih spojeva, oni aktivnim pokretanjem treba da savladaju barijeru utero-tubalnog spoja i uđu u kaudalni istmus jajovoda (fiziološki rezervoar spermatozoida), gde započinje proces kapacitacije. Utero­tubalni spoj je, u stvari, završetak roga uterusa, u čiji lumen prominira završetak istmusa jajovoda, u vidu brojnih edematoznih nabora. Tako ovaj spoj predstavlja morfološku selektivnu barijeru, koju mogu da savladaju morfološki pravilno građeni, vitalni i snažno progresivno pokretni spermatozoidi. Nepokretni i morfološki abnormalni spermatozoidi nisu sposobni da prođu ovu barijeru i dospeju u istmus jajovoda. Neka istraživanja pokazuju da, čak, i spermatozoidi sa genetskim anomalijama, pod normalnim uslovima, ne prolaze utero-tubalnu barijeru. Ustanovljeno je, takođe, da i leukociti iz lumena uterusa ne prolaze barijeru utero-tubalnog spoja. Na taj način se, u jajovodu, formira populacija morfoloski normalnih i vitalnih spermatozoida, zaštićemh od fagocitoze polimorfonuklearnim leukocitima.

Formiranje rezervoara u utero-tubalnom spoju i kaudalnom istmusu (za 1 do 2h posle inseminacije) je vrlo bitno za održavanje vitalnosti, integriteta i kapacitaciju spermatozoida, tokom 24 do 42h, te njihovu završnu migraciju do ampule jajovoda, gde se vrši proces oplodnje. Tokom boravka u kaudalnom istmusu, spermatozoidi se vezuju za cilijarne ćelije epitela zida jajovoda, akrosomalnim regijama svojih glava. Spermatozoidi koji ne uspostave ovu vezu sa epitelnim ćelijama istmusa, uginjavaju ili nisu fertilizaciono sposobni. Neka istraživanja pokazuju da samo spermatozoidi koji nisu započeli proces kapacitacije, imaju sposobnost da uspostave aktivan kontakt sa cilijarnim ćelijama epitela kaudalnog istmusa. Na ovaj način, kaudalni istmus predstavlja rezervoar za održavanje funkcionalne populacije spermatozoida spremnih za fertilizaciju. 

Neposredno pred ovulaciju, verovatno pod uticajem nekog endokrinog signala iz predovulatornih folikula, spermatozoidi završavaju proces denudacije, odvajaju se od epitelnih ćelija kaudalnog istmusa, postaju hiperpokretljivi i pokreću se prema mestu fertilizacije (ampulo-istmusni spoj jajovoda). Ustanovijena je dosta precizna koordinacija između početka ovulacije i pokretanja spermatozoida iz kaudalnog istmusa prema mestu fertilizacije. Možda, u ovoj koordinaciji, neku ulogu imaju i spermatozoidi koji, za nekoliko minuta posle inseminacije, dospevaju u kranijalne partije jajovoda. Oni, možda, na neki način, daju signal kranijalnim delovima ženskog reproduktivnog trakta (jajovod, jajnik) o prisustvu sperme u materici.

Prilikom akta kopulacije, u kranijalni deo cerviksa (na spoju sa telom materice), deponuje se prosečno 250ml sperme, sa nekoliko desetina milijardi spermatozoida. U isti deo materice se, kod klasične veštačke inseminacije, deponuje doza od 80 do 100ml razređene sperme sa 2 do 5 milijardi spermatozoida. Međutim, deponovan volumen ejakulata ili inseminacione doze, kao i broj spermatozoida, značajno se smanjuju tokom transporta i boravka spermatozoida u ženskom reproduktivnom traktu. Tako se, unutar 1 do 2 sata posle osemenjavanja, u uterotubalnom spoju, stvara populacija spermatozoida, čiji broj iznosi 100 do 200 miliona. Iz ove populacije se, u kaudalnom istmusu jajovoda (tzv. funkcionalni rezervoar spermatozoida) formira još manja populacija vitalnih spermatozoida, da bi njihov broj, na mestu oplodnje (zadnja trećina ampule jajovoda), iznosio svega nekoliko hiljada.

Prva značajna redukcija ejakulata ili inseminacione doze, vrši se peristaltičkim (istiskivajućim) kontrakcijama materice, unutar 30 do 75 minuta posle inseminacije. Pokazalo se, naime, da se, u ovom periodu, kroz vaginu i vulvu, u spoljašnju sredinu, izbaci oko 70% do 80% volumena ejakulata ili VO-doze, u kojima se nalazi 25-30% ukupno unesenog broja spermatozoida. Kod svinje je postinseminacioni refluks sperme fiziološki mehanizam, kojim se postiže optimalan broj spermatozoida na mestu oplodnje i nema značajnog uticaja na fertilitet krmača, kada je osemenjene izvedeno sa više od 1x109 spermatozoida, u dozi volumena većeg od 80ml  Međutim, izbacivanje svega 5% spermatozoida, tokom trajanja akta inseminacije, značajno smanjuje vrednost koncepcije. Svi pokušaji da se, na različite načine, izvrši tamponiranje cerviksa, radi sprečavanja postinseminacionog refluksa sperme, nisu imali za rezultat povećanje broja spermatozoida u kranijalnim partijama ženskog polnog trakta. Dalja redukcija broja spermatozoida je uslovljena njihovom athezijom za ciliarne ćelije endometriuma, kao i ulaskom određenog broja spermatozoida u endometrialne žljezde. Osim toga, polimorfonuklearni leukociti uništavaju preostale spermatozoide u rogovima uterusa, unutar 30 minuta posle inseminacije. Konačna redukcija broja i kvaliteta spermatozoida u jajovodu (kaudalni istmus i ampula), vrši se selektivnom propustljivošću uterotubalnih spojeva.

Transport i preživljavanje spermatozoida u ženskom polnom traktu su vrlo kompleksni fiziološki procesi, izazvani interakcijom sperme (spermatozoidi i spermalna tečnost) i materice. Pri tome su, od primarne važnosti kontrakcije miometriuma i polimorfonuklearna infiltracija materice. Oba ova procesa se mogu fiziološki normalno odvijati u periodu pre ovulacije, kada u telesnoj cirkulaciji dominira visoka koncentracija estrogena. Naime, inseminacija posle ovulacije ima za posledicu rani embrionalni mortalitet, pojavu vaginalnog iscetka i regularno povađanje  

Navedene činjenice jasno pokazuju da se ubacivanjem sperme u kranijalnije partije ženskog polnog trakta (telo materice, rogovi materice, uterotubalni spojevi ili jajovodi), volumen inseminacione doze i broj spermatozoida u dozi mogu radikalno redukovati, pri čemu je fertilitet osemenjenih plotkinja isti ili veći u odnosu na klasično intracervikalno osemenjavanje.

 

Plitka intrauterina inseminacija

 

Prve eksperimente sa primenom ne hirurške intrauterine (postcervikalne) inseminacije krmača, izveli su Hancock i  Hovell (1961). Oni su koristili fleksibilni kateter, da ubace inseminaciono dozu, što dublje u rog uterusa. Ustanovili su znatno veći broj normalno razvijenih ranih embriona, 3 do 4 dana posle inseminacije, u odnosu na broj takvih embriona kod krmača osemenjenih klasičnom intracervikalnom inseminacijom.

U poslednje vreme, za plitku intrauterinu inseminaciju (u telo materice), koriste se modifikovani kateteri za klasičnu intracervikalnu inseminaciju. Naime, kroz klasičan katetr je provučen jedan tanji, fleksibilniji kateter, kroz koji se deponuje sperma u telo materice. Procedura inseminacije je sledeća: Vrh klasičnog katera se uvede u cervikalni kanal, kao i kod klasične inseminacije. Zatim se, kroz njega, polako, uvodi tanji kateter, sve do tela materice (u dužini od oko 20cm), gde se izvrši depozicija inseminacione doze sperme. Ako se plitka intrauterina inseminacija izvede dozama koje sadrže 0,5 do 1,0 x 109 spermatozoida, rezultati fertiliteta krmača su vrlo slični onima koji se dobijaju kod klasične intracervikalne inseminacije.

 

Tabela 1. Fertilitet krmača posle intrauterine inseminacije

 

Autor

Inseminaciona doza

Fertilitet krmača

Volumen (ml)

Broj spermatozoida u dozi

% prašenja

Živorođene prasadi u leglu (n)

Vansickle (2002)

100

3,0 x 109

96,7

12,23

50

1,5 x 109

92,8

11,61

30

1,0 x 109

94,1

10,44

Rozeboom i sar. (2004)

85

0,5 x 109

78,0

8,6

85

1,0 x 109

87,0

9,3

85

4,0 x 109

94,4

10,5

851

4,0 x 109

88,2

10,8

Mezalira i sar. (2005)

20

0,25 x 109

78,62

11,82

20

0,5 x 109

85,7

13,0

20

1,0 x 109

88,9

12,8

 

1Klasična intracervikalna inseminacija; 2Vrednost koncepcije i broj živih embriona, ustanovljeno žrtvovanjem  krmača, 34 do 41 dan posle inseminacije.

 

Pre skoro dve godine, započeli smo eksperimente sa primenom plitke intrauterine inseminacije krmača, u proizvodnim uslovima farme “PIK BEČEJ”. Prvi rezultati, dobijeni su osemenjavanjem po 30 krmača intrauterinim kateterima, dozama sa 5, 3,7 ili 2,5 x 109 sprmatozoida. Vrednost prašenja se kretala između 80 i 86%, a broj živorođene prasadi između 10 i 11. Inseminacija klasičnim intracervikalnim kateterima, koji se uobičajeno koriste na farmi, rezultirala je sa 56,7% prašenja i 10,07 živorođene prasadi po leglu. Ovi rezultati, do sada, nisu bili prikazivani. Prema našim saznanjima, kod nas nema istraživanja i rezultata u vezi sa primenom intrauterine inseminacije.

 

Duboka intrauterina inseminacija

 

Duboka intrauterina inseminacija se može izvesti hirurškim putem, pri čemu se metodom laparotomije ili laparoskopije, pristupa do vrhova rogova uterusa, u koje se deponuju inseminacione doze razređene sperme, vrlo malog volumena (0,5 do 2ml), sa svega nekoliko miliona, do nekoliko stotina miliona spermatozoida. U poslednje vreme se primenjuje ne hirurška metoda duboke intrauterine inseminacije, za koju se koristi klasičan kateter, kroz koji prolazi dugačak fleksibilni, tanji, kateter za depoziciju sperme. Obe metode imaju za cilj da se inseminaciona doza deponuje što bliže vrhu roga meterice, tj. utero-tubalnom spoju.

Postoji relativno malo podataka o fertilitetu krmača, posle duboke intrauterine inseminacije, izvedene hiruruškim ili ne hirurškim putem. Tako su osemenjavali krmače sa 1x109, 1x108, 1x107, 5x106 i 1x106 spermatozoida, u dozi volumena 0,5ml. Pokazalo se da % prašenja i veličina legla nisu bili značajno različiti, od ovih vrdnosti dobijenih klasičnom intracervikalnom inseminacijom, ako je intrauterina doza sadržavala više od 1x106 spermatozoida. Vrlo dobre rezultate prašenja (87 do 89%) i veličine legla (9,4 do 9,8), dobili su i drugi autori, posle transcervikalne duboke intrauterine inseminacije, sa 20x106 spermatozoida, u dozi od 5ml. Izgleda da je dovoljno uvesti fleksibilni kateter 30 do 40cm u rog, kranijalno od bifurkacije uterusa, da bi se dobili dobri rezultati fertiliteta krmača, osemenjenih dozama volumena 10 do 20ml, koje sadrže 1 do 5x108 spermatozoida.

 

Mesto depozicije insemminacione doze

Intracervikalno_osemenjavanje

Intracervikalno

Plitko-intrauterino_osemenjavanje

Plitko intrauterino

Hirurška inseminacija

 

Hirurška metoda se koristi da bi se vrlo male doze, sa vrlo malim brojem spermatozoida, deponovale direktno u uterotubalne spojeve ili jajovode. Tako su Polge i sar. (1970) dobili visoke vrednosti fertiliteta krmača, kada su, hirurškim putem, ubacili svega 0,5ml doboko zamrznute-otopljene razređene sperme, sa oko 1 x 107 spermatozoida, direktno u jajovod, 6h pre ovulacije. Slične rezultate, primenom sličnog hirurškog protokola, u farmskim uslovima, dobili su Schoenbeck i sar. (1995). Rezultati nekih autora pokazuju da se zadovoljavajuće vrednosti fertiliteta nazimica, posle hirurške inseminacije u vrhove rogova uterusa, postižu sa dozom minimalnog volumena 0,5ml, u kojoj se nalazi minimalno 1 x 106 progresivno pokretnih spermatozoida.

Neka istraživanja pokazuju da se hirurška inseminacija navedenim dozama može izvesti u samo jedan vrh roga materice, pri čemu nema razlike u vrednosti fertilizacije i ranog embrionalnog razvoja, između roga u koji je izvršena depozicija sperme (ipsi-lateralni rog) i onaga u koji nije deponovana sperma (kontra-lateralni rog). Kako spermatozoidi iz ipsilateralnog dospeju u contralateralni rog i, dalje u jajovod, i uspešno oplode oocite ovulirane u taj jajovod, ostaje da se razjasni.

 

Umesto zaključka

 

Intrauterina inseminacija se sve više primenjuje u tehnologiji praktičnog veštačkog osemenjavnja svinja, zbog sledećih prednosti ove, nad metodom klasične intracervikalne inseminacije:

  • Moguće je koristiti inseminacione doze znatno manjeg volumena, sa zantno manjim brojem spermatozoida.
  • Na ovaj način se povećava broj inseminacionih doza, koje se mogu dobiti od jednog ejakulata, odnosno moguće je osemeniti znatno veći broj plotkinja.
  • Znatno se smanjuje cena koštanja jedne inseminacije.
  • Tehnika samog izvođenja transcervikalne intrauterine inseminacije je relativno laka i traje približno isto koliko i klasična intracervikalna inseminacija.
  • Smanjen je transvaginalni refluks sperme, posle inseminacije i bolji transport spermatozoida do utero-tubalnih spojeva (fiziološkog rezervoara spermatozoida).
  • Pri tome je fertilitet osemenjenih plotkinja sličan ili veći od onog koji se postiže klasičnom intracervikalnom inseminacijom.

 

Nedostaci ove metode su sledeći:

  • Nije moguće osemenjavati nazimice, posebno ne u prvom ili drugom pubertetskom estrusu, zbog malih dimenzija njihovih reproduktivnih organa (posebno cerviks, telo i rogovi uterusa). Naime, depozicijom intrauterinog katetara, često dolazi do ozleda ovih organ i postinseminacionih krvavljenja.
  • Nije moguće intrauterino osemenjavati ni odrasle krmače, koje su, prethodno, imale težak porođaj, sa povredama (priraslicama) na unutrašnjim polnim organima. Takve promene mogu onemogućiti prolaz katetera, ili kateter može izazvati njihovu ponovnu povredu. To može imati za posledicu postinseminaciono krvavljenje i dalje komplikacije.
  • Primenom nesterilisanih katetera, vrši su unošenje infektivnih agenasa u dublje partije materice.
  • Potrebna je primena skupljih katetra, posebno dizajniranih za intrauterinu inseminaciju, kao i dodatna edukacija stručnjaka.

 

Iako primena intrauterine inseminacije može imati značajnih pozitivnih efekata u proizvodnji svinja, potrebna su dalja eksperimentalna istraživanja u vezi sa: (a) fiziologijom transporta i preživljavanja spermatozoida i ženskom polnom traktu, (b) određivanjem minimalnog broja spermatozoida u inseminacionoj dozi, (c) formulisanjem optimalnog dizajna intrauterinih katetera  i (d) optimalne dubine depozicije sperme u rogove uterusa, za postizanje maksimalnog fertiliteta osemenjenih krmača.

 

Jajnik-svinje-skica

 

 

Dubljom depozicijom sperme značajno se smanjuje

volumen sperme i broj spermatozoida u dozi

A - Intracervikalno 2 - 5X109 /80 - 100 ml,

B - Plitko intrauterino 0,5 - 1X109 /20 - 50 ml

C - Duboko intrauterino 1 - 5X108 /10 - 20 ml

D - Hirurški u vrh roga materice 1 - 5X106 /0,5 - 2 ml

 

 

Jajnik-svinje-skica2

 

 

Moguća mesta cervikalne depozicije sperme

A - Intracervikalno

B - Plitko intrauterino

C - Duboko intrauterino

 

Prof. dr Blagoje Stančić

University of Novi Sad
Faculty of Agriculture
Animal Sciences Department
Animal Reproduction Div.
Trg Dositeja Obradovića 8
21000 Novi Sad, Serbia
Tel.: +381 21 485 34 82

 

Knjige ovog autora:

 

Knjiga1 Knjiga2 Knjiga3 Knjiga4 Knjiga5 Knjiga6

 

Kliknite za sliku za veći prikaz


Prijavi se

Pretraži sajt

petshop logopitajte-veterinara

Oglasi za posao

veterina.info fan box