Metode prezervacije sperme pasa

(Dog Semen Preservation Technology)

 

 

Zaleđena pseća sperma može da se čuva praktično neograničeno dugo i tehnika kao i extendori za crioprezervaciju razvijeni u poslednjih par godina, rezultirali su očuvanjem pokretljivosti posle otapanja do 70% kao i uspešnosti oplodnje do 85%. Ohlađena sperma koja zahteva mnogo manje uslova i manje finansijskih sredstava sve je popularnija kako među uzgajivačima pasa, tako i među kliničarima koji manipulišu spermom pasa. Svaka manipulacija semenom, podrazumeva prethodnu pažljivu i profesionalnu kontrolu kvaliteta semena. Pregledom volumena, boje, motiliteta kao i morfologije sperme možemo doneti pravilnu odluku o upotrebi sperme za veštačku oplodnju kuje.
Izbor metode prezervacije semena može biti različit i zavisi od nekoliko faktora. Nekada je u pitanju potreba da se izvrši oplodnja kuje u istom danu ili u sledećih nekoliko dana, nekada se seme transportuje na manju ili veću razdaljinu, a nekada je to prosto želja vlasnika životinje da se čuva genetski material kvalitetne jedinke.
Pre svake manipulacije semenom pasa, neophodno je izvršiti detaljan pregled životinje, kao i kontrolu kvaliteta sperme, koja podrazumeva pregled boje volumena, određivanje ukupnog broja spermatozoida i koncentracije sperme, zatim provera pokretljivosti kao i morfologije spermatozoida.

Metode uzimanja uzorka ejakulata-semena

Najčešće u praksi koristimo digitalno manuelnu masažu – masturbaciju za uzimanje semena pasa. Digitalno manualna tehnika se može sprovesti sa ili bez veštačke vagine na koju je pričvršćena graduisana epruveta od 15 ml.
Ako ste desnoruki, priđite psu sa leve strane i desnom rukom prevucite prepucijum preko penisa. U levoj ruci se nalazi kolektor za seme. Kada se postigne erekcija, potrebno je rukom pričvrstiti stegu iznad bulbus glandis-a poput prstena i tako će se održati erekcija i početi ejakulacija.
Posle prve frakcije, važno je prikupiti sav ejakulat. To može da traje 5-15 minuta. Nekim psima je nophodna stimulacija (vata natopljena iscedkom kuje u teranju ili sama kuja u teranju).
Osim ove, moguća je elektroejakulacija kao i uzorkovanje spermatoazoida iz epididimisa tokom kastracije pa čak i nakom smrti psa, pa čak i ispiranjem vagine nakon prirodnog parenja. Ove metode se češće koriste kod mačaka, kod kojih je zbog temperamenta i ponašanja nemoguće uraditi digitalno manuelnu metodu! Ejakulat prikupljen elektroejakulatorom generalno ima veći volumen, manji ukupan broj spermatozoida i viši pH od ejakulata uzetog digitalnom metodom.

Pregled sperme

Laboratorijski pregled sperme podrazumeva pregled:

 

Boje ejakulata

Ejakulat psa ima mlečno belu boju. Crvene primese indikuju prisustvo krvi i probleme sa prostatom. Primesa žute ukazuje na kontaminaciju urinom ili ređe prisustvo gnoja ili drugih izlučevina iz epididimisa ili prostate.

Volumena

 

Volumen ejakulata varira u odnosu na rasu, veličinu psa kao i na količinu prikupljene prostatične tečnosti.
Nema mnogo važnosti da li smo prikupili kompletnu treću frakciju prostatične tečnosti, takođe i za V.O. nama prva frakcija nije neophodna. Važno je na kraju uzimanja uzorka tačno utvrditi volumen uzorka kako bi se na osnovu broja spermatozoa u ml uzorka mogla utvrditi koncentracija. Ovo je važno i za kasniju prezervaciju sperme.

 

Motilitet spermatozoida

 

Pokretljivost spermatozoida se može sprovesti subjektivno pod mikroskopom „u masi“ kada subjektivno određujemo procenat pokretljivih ćelija. Ovo se obavezno sprovodi u povoljnim uslovima za ćeliju na grejnoj ploči koja održava temperaturu mikroskopske pločice na 37^oC kako bi se izbegli artefakti. Takođe je moguće analizirati pokretljivost spermatozoida pomoću CASA sistema, koji uz pomoć specijalnog softvera daje jasnu sliku o pokretljivim spermatozoidima:
Procenat ukupne pokretljivosti (TM%)
Linearna pokretljivost spermatozoa (progresivna pokretljivost – ubrzanje PM%^*)
Prosečna brzina puta (VAP mikrometer/s)
Brzina pravolinijskog kretanja (VSL mikromet/s)
Brzina krivolinijskog kretanja (VCL mikromet/s)
^* PM% se izračunava od rezultata dobijenog od ukupne pokretljivosti i brzine izračunate od speramtozoida koji pokazuju pravolinijsko kretanje.

 

Morfologiju spermatozoida

 

Morfološke promene spermatozoida mogu nam dati odgovore ne samo o sposobnosti spermatozoe da izvrši fertilizaciju oocita, već nam mogu dati odgovore gde su nastali defekti na ćeliji. Na osnovu promena na ćelijama jasno možemo znati da li se radi o defektima nastalim u testisima u toku spermatogeneze ili u toku pasaže kroz epididimis u procesu kapacitacije i sazrevanja spermatozoida.

 

Koncentraciju sperme i ukupan broj spermatozoa u ejakulatu

 

Broj spermatozoida u ml ejakulata nazivamo koncentracijom spermatozoida. Ona se može odrediti jednostavnim brojanjem ćelija pomoću hemocitometra ili pomoću automatskih fotometara kalibrisanih za spermatozoide pasa.
Ukupan broj spermatozoida se izračunava kada se koncentracija sperme pomnoži sa volumenom ejakulata i dobije se ukupan broj spermatozoida u ejakulatu.
Zaleđena pseća sperma može da se čuva praktično neograničeno dugo, i tehnika kao i extendori za crioprezervaciju razvijeni u poslednjih par godina i rezultirali su očuvanjem pokretljivosti posle otapanja do 70% kao i uspešnosti oplodnje do 85%. Ipak, stopa graviditeta i oplodnje je niža sa zaleđnom spermom nego kod ohlađene kod istih optimalnih uslova AI. Tehnički je lakše ohladiti nego zalediti spermu, transport je jeftiniji i regulativa prilikom uvoza i izvoza je manje komplikovana.
Posledično, međunarodni transport ohlađene sperme je sve češći. Jedina mana /ograničenje/ ove tehnike je relativno kratak vek preživljavanja, što znači obaveznu upotrebu nekoliko dana po prikupljanju. Znači da transport ovako pripremljene sperme podrazumeva pažljivo planiranje kako da seme ostane fertilno, tako i da kuja bude u dobrim danima za inseminaciju.
Da bi se održala sposobnost za ćelije sperme (fertilitet), pseća sperma mora biti razređena, extendovana i ohlađena. Zavisno od dužine vremena potrebnog da se seme čuva možemo govoriti o manipulaciji svežom, hlađenom ili duboko zaleđenom spermom.

Priprema sveže sperme:

 

Ukoliko ejakulat nije dobro frakcionisan (odvojene frakcije) preporučuje se centrifugiranje uzorka 5-10 minuta na 600 do 700 G kako bi se odstranio višak prostatične tečnosti, koji može nepovoljno da utiče na uzorak ukoliko planiramo da odstoji neko vreme. Centrifugiranje ejakulata je naročito važno ukoliko u spermi postoje primese krvi ili urina, što viđamo kod pasa koji pate od prostatične hiperplazije ili zapaljenja prostate. Uočeno je da hemoglobin iz prisutnih eritrocita veoma utiče na sposobnost i kvalitet spermatotozoida zaleđene sperme, kao i na spermatozoide drugih životinjskih vrsta, ali ne i na svežu spermu ili hlađenu spermu pasa. Nekada se daje preporuka da se ovakvo sumnjivo seme uzima direktno u epruvetu sa pripremljenim extendorom u koji nećemo staviti žumance (centrifugiranjem bi se ovaj extendor koagulisao i žumance bi palo na dno epruvete).
Nekada psi koji pate od zapaljenja ili oboljenja prostate, izlučuju veoma mali volumen prostatične tecnosti, i tada imamo veoma koncentrovanu spermu, pa je rastvaranje u extendorima još veća pomoć kako bismo dobili veći volumen za aplikaciju u toku A.I. Ovakvi psi, sa problemima ili sumnjom na probleme sa prostatom bi trebalo obavezno pregledati i bakteriološkim ispitivanjima.

 

Hlađeno, rastvoreno seme

 

Sperma koju planiramo da lagerujemo na neko vreme ili transportujemo, mora obavezno da bude rastvorena kako bi joj se produžio vek. Obavezno pre toga mora biti centrifugovana kako bi se odstranila prostatična tečnost.
Extendor (rastvarač) služi da zaštiti ćelijsku membranu koju uzrokuje pomena temperature kao i mešanje i mućkanje tokom transporta, dok istovremeno daje neophodni izvor energije živim ćelijama u semenu i održava potreban pH. Neophodno je da u sebi sadrži antibiotike. Ovo je naročito vazno ukoliko koristimo rastvarače koji u sebi sadrže žumance jajeta koje je dobra podloga za razvoj bakterija. Dakle, hlađenjem, usporavamo metaboličke procese u spermi i produžavamo joj vek.
Testirano je puno različitih rastvarača. Poznati reprodukcionisti sveta potpisali su formule za rastvarače (Andersen, Concannon, Battista...) ali jedan od najčešće korišćenih je Tris-citrat bufer koji sadrži fruktozu ili glukozu, 20% žumanceta kokošijih jaja, i naravno antibiotike koje smo spomenuli (Linde-Forsberg 1995). Isti autor je razvio i extendor sa 80% masne, pasterizovane i homogenizovane pavlake (12% masti) i 20% žumanceta.
Pre mešanja uzorka semena sa rastvaračem, obavezno je proveriti da rastvarač i seme imaju istu tmperaturu kako bi se izbegao hladni šok i naravno obzirom da je lumen uterusa kuje relativno mali, volumen korišćenog rastvarača ne bi trebalo da prelazi količine 1-3 ml za IU tj. 3-5ml za IV inseminaciju (naravno i ovo zavisi od veličine i rase kuje).
Hlađenje počinje ostavljanjem rastvorenog semena u frižideru u trajanju od 30-60 minuta kako bi se dostigla temperatura od +4^oC, i ovako pripremljeno seme sa pažnjom i kvalitetnom spermom sačuvaće sposobnost fertilizacije nekoliko dana (komercijalno se koristi do nedelju dana mada postoje radovi koji tvrde da je taj period i duži).
Ukoliko se za transport koristi termos-bočica, obložite je pokvašenom vatom kako bi se izbeglo lupanje epruvete o zidove termosa i ostavite neko vreme u frižideru zajedno sa semenom da se temperatura izjednači u termosu. Ukoliko se koristi led u termosu ili u specijalnoj kutiji za pakovanje koja ima “zaleđene pingvine” veoma je važno da se epruveta dobro izoluje od direktnog kontakta sa ledom, pre svega zbog hladnog šoka, jer bi se time potpuno dezintegrisala membrana spermatozoe. Oštećeni spermatozoidi, možda čak mogu da pokažu sasvim dobar motilitet, ali da zbog niske temperature i oštećenja enzima, bude smanjena fertilizaciona sposobnost. Dakle, treba izbegavati sve fluktuacije temperature.
Jedan od najboljih načina transporta ovako prezervirane sperme je originalna kutija (neopore box), koja može da zadrži temperaturu do 48h transporta.
Hlađeno seme pre upotrebe treba postepeno zagrevati do sobne temperature, pre upotrebe za inseminaciju.
Osim dobrog postupanja sa semenom i načina transporta, jedan od ključnih uslova uspeha ove metode je i dobar tajming i priprema kuje.
Sećam se slučaja upotrebljenog semena posle 8 dana čuvanog u frižideru da je rezultiralo leglom od 6 labrador-retrivera.
Uzimajući u obzir da je cena koštanja ove pripreme sperme i transporta semena, trećina ili čak četvrtina cene za smrznuto seme, razumljivo je zašto je ova metoda toliko zanimljiva i komercijalno opravdana!

 

Zaleđena sperma

 

Pseće seme se najčešće smrzava u 0,5 ili 0,25 ml cevčicama ili peletama. Iako su obe (cevčice i pelete) dale jednako dobre rezultate, cevčice su više higijenske, jednostavnije za obeležavanje, lagerovanje i otapanje, pa se koriste češće.
U procesu krioprezervacije, sperma će biti hlađena sa temperature tela do temperature tečnog azota (-197^oC) a kasnije obrnuto, otapana naglo do temperature za inseminaciju. Izazov za ćelije nije opstanak na temperaturi nitrogena, jer na ovoj temperaturi seme može da opstane praktično beskonačno dugo, ali je važan opstanak u toku menjanja temperature ispod i iznad 0^oC u toku smrzavanja i otapanja . Oštećenja na spermatozoidima na temperaturi od 0˚C se zove COLD SOK! On dovodi do smanjenja motiliteta, nepravilnih pokreta ćelija, utroška energetskih izvora, povećanog permeabiliteta ćelijske membrane otpuštanja jona iz citoplazme i smrti ćelije. Glavni stres za ćeliju nastaje zbog promene u osmolaritetu, dehidratacije i stvaranja oštrih ledenih kristala koji mehanički oštećuju ćelijsku membranu. Promene na ćeliji se dešavaju i u toku prebrzog smrzavanja, jednako kao u toku prespore procedure. Kod prebrzog postupka, do smrzavanja dolazi u unutrašnjosti ćelije, dok kod presporog zamrzavanja voda napušta membranu ćelije i kristali leda se stvaraju na spoljnoj strani ćelijske membrane koju oštećuju.
Kako bi se smanjila mogućnost nastajanja hladnog šoka i oštećenja spermatozoida u toku krioprezervacije, spermu je neophodno razrediti specijalno pripremljenim ili komercijalnim razređivačima extenderima i krioprotektantima) a protokol hlađenja do smrzavanja, kao i otapanja mora biti strogo kontrolisan. Glavni krioprotektant koji se koristi u extenderima je glicerol.
Rastvaranje semena za zamrzavanje može biti izvedeno u jednom ili dva koraka. Metoda koju ću vam opisati podrazumeva dva koraka rastvaranja sa dva veoma slična, a ipak različita rastvarača koja se po sastavu, pre svega razlikuju prema sadržaju glicerola. Zašto se ovo radi? Pre svega, kako bi se rastvorena sperma sa prvim rastvaračem ohladila na temperaturu od 4˚C, dok se istovrmeno i drugi rastvarač hladi na jednaku temperatutru. Ovo se može raditi pomoću kontrolisanog frižidera ili čak i pomoću rashladne kutije. Ovako hlađeno seme treba na temperaturi od 4˚C čuvati 1-2 sata (neki protokoli čak kažu 4 sata). Tek nakon ovog hlađenja seme može da se smrzava.
Dakle, dodali smo extendor broj dva, koji sada u sebi ima nešto veću koncentraciju glicerola i počinjemo smrzavanje. Za ovaj postupak, mi smo u klinici koristili tank sa tečnim azotom u tri koraka. Dakle, pripremljene, obeležene i upakovane cevčice sa semenom smo hladili iznad nivoa tečnog azota u tri koraka i svaki put u razmaku od 2, tj. 1 minuta (7 cm od gornje ivice tanka 2 min, 13 cm od ivice 2 min, 20 cm od ivice 1 min). Svakim korakom smo bili bliže površini tečnog azota, ili ih uranjamo, a cevčice su praktično hlađene i smrzavane u pari azota (poslednji korak je na 4 cm iznad nivoa u tanku). Ovo pokazuje koliko je važno da se uvek dobro zna koliki je nivo azota u tanku, koliko je važno da se svaki korak protokola ispoštuje sa velikom pažnjom, i kada se jednom ovaj postupak obavi kvalitetno, dobićete spermu koja praktično ZAUVEK može da se koristi.

 

AUTORI:

DVM Msc Bojana Bobić Gavrilović ,
Mr. Sci. Vladimir Magaš

 

Reference:

Andersen K (1972) Fertility of frozen dog semen. Acta Vetrinaria Scandinavica, 13: 128-130

Davies PR.(1982) A study of spermatogenesis, rates of sperm production, and methods of preserving the semen of dogs.PhD Thesis, University of Sidney.

England GCW, Allen WE (1989) Seminal characteristics and fertility in dogs. Vet Rec 125:399

Hermasson U and Linde-Forsberg C (2002) Freezing of stored,chilled dog spermatozoa. Proc 3^rd ECSSAR Congress,Lige, 107-108

Hermasson U and Linde-Forsberg C Freezing of stored,chilled dog spermatozoa. (2006) Theriogenology 2006;65:584-594

Linde-Forsberg C (1995) Artificial insemination with fresh, choilled and frozen-thawed semen in the dog. Sem Vet Med Anim Pract 21:467-485

Pena AI and Linde-Forsberg C (2000) Effects of spermatozoal concentration and post-thaw dilution rate on survival after thawing of dog spermatozoa. Theriogenology 54 703-718

Ponglowhapan S, Essen-Gustavsson and Linde-Forsberg C.Influence of glucose and fructose extender durng long term storage of chilled canine semen. Theriogenology 2004; 62:1498-1517

Linde-Forsberg C , StormHolst B and Govtte G (1999) Comparison of fertility data from vaginal vs uterine insemination of frozen-thawed dog semen: a retrospective study. Theriogenology 52 11-23

Silva LDM, Onclin K, Snaps F, Verstegen JP (1995) Laparascopic intrauterine insemination in the bitch. Theriogenology 43 615-623

Wilson MS (1993) Non surgical intra-uterine insemination in bitches using frozen semen. Journal of Reproduction and Fertility 47 (Suppl) 307-311

Wilson MS (2001) Transcervical insemination in the bitch. Proceedings SFT/ACT Annual Conference and Canine Symposium, Vancouver, 295 – 301

Daurio, C.P. Rproductive evaluation of male Beagle and safety of ivermectin American Journal of Veterinary Research 48, 1755-1760

England, G.C.W. (1989) Seminal caractheristics and fertility in dogs. The Veterinary Record 125, 399.

England, G.C.W. (1998) Transportation and interaction of dog spermatozoa within reproductive tract of the bitch. Advances in Canine Reproduction CRB Report 3, Uppsala, pp 57-84