Brachyspira

Brachyspira hyodysenteriae je etiološki izazivač dizenterije kod svinja.  Ovaj organizam može biti demonstriran veoma lako u ostruganoj mukozi kolona inficiranih svinja. Kao i uvek, zbog nepatogenih   B. innocens  i drugih spiroheta koje se često mogu naći u svinja, neophodno je  kultivisati B. hyodysenteriae da bi se dobila precizna/tačna dijagnoza dizenterije svinja. Samo pronalaženje velikog broja spiroheta na ostruganoj mukozi nije dovoljno za dijagnoszu.

B. hyodysenteriaei i B. innocens su anaerobi i za izolaciju i razmnožavanje se mora koristiti anaerobna tehnika. Oni moraju biti izolovani iz mukoze kolona ili rektalnog brisa. Uzorci se trebaju zasejati na triptoza soja agar koji sadrži  5% goveđe krvi i 400 ug/ml spektinomicina.   Veoma  koristan je medij BJ koji je razvijen ovde na  ISU. (BJ označava Bob Kunkle i JoAnn Kinyon.)  Ovaj medijum sadrži ekstrat svinjskog fecesa da poboljša rast i otkrije organizme. Ploče se stave u Gas-Pak lonce, ili Bio-Bag sistem koji sadrži zaštićene kristale i anaerobnu atmosferu sa  H₂ i CO₂ ( generator koverat).

Fenomen prstena.  Sledećih 2-6 dana inkubacije na 42⁰C, B. hyodysenteriae se pojavljuje kao male delimično providen beta hemolitične “kolonije” i B. innocens će prikazati slabu hemolizu. Oba organizma proizvode mali površinski rast i većina studenata uoče samo zone hemolize na agaru. Da bi se proverio   fenomen prstena, treba odstraniti komad agara iz zone  gde organizmi rastu i i vratiti ploču natrag u anaerobne uslove. Ploče se inkubiraju  1 do 2 dana i uočiće se povećani intenzitet hemolize oko mesta gde je odstranjen komad  B. hyodysenteriaekulture.

Borrelia

U ovom rodu nalazi se patogen Borrelia burgdorferi etiološki izazivač Lajmske bolesti i B.anserina koja prouzrokuje akutnu septikemiju, diareju i anemiju kod živine. Ti anaerobni organizmi su primarno prvo preneseni krpeljima i nešto su teži za kultivisanje.

Literatura: dr Veselina Radanov Pelagic (sfscentar.com), dr Ronald Griffit, OSNOVI TEHNIKE VETERINARSKE MIKROBIOLOGIJE - radna sveska

Pripadnici roda Brucella su primarni patogeni infektivni agensi genitalnog trakta životinja. Uzrokuju abortus i infertilnost. Različite vrste  Brucella su prvo izolovane iz njihovog odgovarajućeg prirodnog domaćina. Prirodni domaćini su dati u Tabeli 18.  Veoma je važno da znate da čovek takođe može biti inficiran od strane B. abortus, B. melitensis, B. suis, i B. canis.  Te rodove treba determinisati kada se izoluje Brucella . Treba biti veoma pažljiv kada se radi sa tim organizmima. Infekcija nastala u laboratoriji nije neuobičajena.

Organizmi roda Brucella su mali, nepokretni, nesporogeni kokobacili.. Oni su aerobni do mikroaerofilni organizmi, od kojih većina raste najbolje kada se inkubira u atmosferi sa povećanom koncentracijom CO₂. Brucella  neće rasti na jednostavnim medijima kao što je hranjivi agar. Triptoza  je potrebna za rast i serum za stimulaciju rasta. Kada se sumnja na Brucella bakterije  Ploče se inkubiraju na 37⁰C u  10% CO₂ atmosferi.  Posle  4 dana inkubiranja, pojaviće se male, okrugle glatke  Brucella kolonije. Ako nema rasta, ploče treba držati bar još jednu nedelju u inkubiranju, kako bi se rezultat mogao proglasiti negativnim.

Brucella su nepokretne, katalaza pozitivne metilcrveno negativne, VP negativne i indol negativne bakterije.  Vrste Brucella se prvenstveno razlikuju u determinaciji da li, ili ne rastu na triptoznom agaru koji sadrži različite koncentracije odnosa [tionin: (i) 1:25,000, (ii) 1:50,000, (iii) 1:100,000, i bazični fuksin: (i) 1:50,000, (ii) 1:100,000].  Ostali važni testovi za diferencijaciju vrsta Brucella uključuju testove ureazu, oksidazu, H₂S proizvodnju i  CO₂ zahteve.  Aglutinacioni testovi sa  A, M, i R antiserumima su takođe od pomoći u identifikaciji vrsta..

Campylobacter

To su mikroorganizmi mali, pleomorfni, Gram‑negativni, krivi štapići. Ponekad spiralne ili "galeb" forme se mogu evidentirati. Mnogi od tih organizama su ranije klasifikovani u rod Vibrio.  Campylobacter vrste su  mikroaerofilne do anaerobne i ne fermentaišu šećere. Ovaj rod uključuje obe vrste i komensalne i patogene mikroorganizme.

Kada se sumnja na  Campylobacter, treba inkubirati agar ploče u uslovima gde je CO₂ ispod 10% plus malo H₂ gasa (Campy uslovi) na 37⁰C nekoliko dana sve dok se ne uoče čestice Gram negativni, pokretni,  krivi štapići.  Komercijalno dostupni Campy sredina je u bio-bag sistemu, koji je pomenut u sekciji za tehnike anaerobnih kultura.

Campylobacter mikroorganizme je ponekad teško izolovati i identifikovati, i neki uginu brže ili promene karakteristike u kontinuiranoj kulturi.

Gram-bojenje  Obratite pažnju na različite oblike ovih organizama, galebova krila ili spirala.

Vibrio

Pravi ili krivi Gram‑negativni štapići roda Vibrio su prvo izolovani iz sveže ili morske vode.  Vibrio cholerae  humani partogen, je najviše vredan pažnje zbog više epidemija kolere koje su zabeležene u istoriji medicine. Jedan od mnogih tipova  V. cholerae je takođe poznat kao Vibrio metchnikovi,  koji prouzrokuje fatalne gastroenteritise kod kokoši.  Ova bolest je prvo uočena i saopštena u Evropi.

Drugi organizam, Vibrio parahaemolyticus se ćesto izoluje iz morske vode i morske hrane.  On je značajan kao humani patogen prvenstveno kao morska hrana-nosioc  "trovanja hranom".  On je takođe uočen kao prouzrokovač nekrotičnih lezija kod riba i ljuskara.

Diferencijacija  Campylobacter vrsta

Napomena:  C. jejuni proizvodi pozitivnu natrium hipurat reakciju.

Literatura: dr Veselina Radanov Pelagic (sfscentar.com), dr Ronald Griffit, OSNOVI TEHNIKE VETERINARSKE MIKROBIOLOGIJE - radna sveska

Nesporulirajući anaerobi

Za razliku od saznanja o ulozi koje sporoformne anaerobne vrste imaju u bolestima, veoma malo se zna o ulozi  nesporolurajućih anaerobnih vrsta.Većina tih organizama su pravi anaerobi koji su veoma  izbirljivi i teško ih je izolovati i identifikovat. Samo ako u narednim godinama bude razvijena tehnika koja omogućava proučavanje uloge tih organizama u animalnim bolestima.

Infekcije koje su u vezi sa anaerobima uključuju:  gnojne apscese mekih tkiva, rane, ozlede, septikemiju, gangrenu, truležno oboljenje papaka, endometritis, i post‑operativne infekcije.  Bacteroides, Dichelobacter i Fusobacterium su uglavnom anaerobni rodovi koji se izoluju iz infekcija životinja. Takođe, često je uočena i mešana infekcija sa bakterijama iz roda Clostridium.

Gasno-tečna hromatografija.

Anaerobni organizmi se često razlikuju po krajnjim produktima koji se mogu detektovati upotrebom gasno-tečne hromatografije.  Male količine baktreijske kulture se ispari u gasnom hromatografu meri se tip i količina masnih kiselina. Bacteroides i Dichelobacter  proizvode različite organske kiseline.  Buterna kiselina nije isključivi krajnji produkt,  i  kada se proizvodi, i izobuterna proizvodi se i izovalerianska kiselina takođe.  Fusobacterium sa druge strane proizvodi isključivo buternu kiselinu kao krajnji proizvod, i ne proizvodi ostale dve pomenute kiseline. Mi nemamo odgovarajući  funkcionalan gasno-tečni hromatograf za detekciju  ovih kiselina.

Da bi se izolovao anaerob, potrebno je ispravno uzeti uzorak koji zahteva anaerobne uslove i pri uzimanju uzorka, transportu i kultivisanju. Sprovođenje tih zahteva je najveći problem u dijagnostici bolesti,  koji prouzrokuju anaerobni mikroorganizmi.

Tehnika uzimanja uzorka Uzorkovanje anaeroba i tehnika kultivisanja će biti demonstrirani i diskutovani na ovoj laboratorijskoj vežbi.  Neke napomene su date ovde:

Tamponi Specijalne tampone za anaerobne kulture treba koristiti kada se sumnja da su oni uzročnici bolesti. Ti tamponi su komercijalno dostupni ili se mogu pripremiti kao duple epruvete koje sadrže CO₂.  Zatvarač epruvete je dodanti sterilni tampon. Jednom se uzme uzorak i vrati se tampon u odgovarajuću epruvetu. Komercijalni sistem je verovatno lakši za praktičare.

Ploče  Potrebni su specijalno pripremljeni anaerobni pločasti mediji. Takođe su dostupni i komercijalni. Te ploče treba držati u anaerobnim uslovima.

Gas-Pak posude (lonci)  Inkubacija ploča mora se odvijati pod anaerobnim uslovima i različite gas-pak posude i drugi sistemi su nam danas dostupni. Gas-Pak lonac  sastoji se od zapečaćenog kontejnera. Sistem za generisanje H₂ gasa je sadržan u jednoj kesici..  Voda se doda  u kesicu upravo pre nego se ona stavi u lonac. U hemijskoj reakciji iz kesice troši se kiseonik iz lonca i tako stvaraju anaerobni uslovi.

Bio-Bags ( Bio- Kese).  Jedan od najlakših i najnovijih anaerobnih sistema je Bio-Bag sistem.  To nije ništa drugo nego plastična kesa u koju se stavlja ploča. Kese se zatvore sa aparatom za toplotno zatvaranje  ( kao što je  Seal-a-Meal) i anaerobni uslovi se generišu sa minijaturnim hidrogen gas generatorom i zaštićenim kristalima. Ovaj sistem ima dugu trajnost i jeftiniji je od gas-paklopaca. Oni takođe zauzimaju manje mesta pri inkubiranju. Dodatna prednost  ovog  sistema  za generisanje drugih uslova sredine kao što je dodatak CO₂  i mešani vazduh je takođe moguć..

PRAS  Pre-Redukcije Anaerobino Sterilisan je termin koji opisuje medij iz kojeg je O₂ veoma pažljivo odstranjen tokom njegove pripreme. Za pripremu tih medija je potrebna specijalna oprema.

Oxyrase (oksiraza) je komercijalni enzimski sistem za uklanjanje  O₂ iz medija i drži ga u vezanoj formi..  Enzim je inkorporiran i dozvoljava rad sa anaerobima u manje  strogim uslovima.  Mi ne koristimo te komponente jer imaju relativno visoku cenu.

Literatura: dr Veselina Radanov Pelagic (sfscentar.com), dr Ronald Griffit, OSNOVI TEHNIKE VETERINARSKE MIKROBIOLOGIJE - radna sveska